出生缺陷影響健康。有數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)前已知的出生缺陷病種超過8000種，其中神經(jīng)管畸形是常見的一類出生缺陷。出生缺陷的發(fā)生與早期胚胎發(fā)育異常直接相關(guān)。因此，研究早期胚胎發(fā)育過程、探究發(fā)育機(jī)理，是揭示病理性胚胎發(fā)生機(jī)制，提升相關(guān)疾病診療效率，從根源上提高健康水平的重要前提。

　　人早期胚胎發(fā)育起始于受精卵（胚胎期第0天；day post-fertilization 0；d.p.f. 0）。受精卵經(jīng)過數(shù)次卵裂形成囊胚，囊胚于d.p.f. 7左右種植入母體子宮并進(jìn)一步發(fā)育，于d.p.f. 14啟動原腸運(yùn)動。原腸運(yùn)動是早期胚胎發(fā)育過程中的重要事件。在此過程中，胚胎細(xì)胞發(fā)生大規(guī)模分化、遷移和重排，并形成外、中、內(nèi)三胚層和體軸。外胚層于d.p.f. 20左右進(jìn)一步發(fā)育形成位于中間的神經(jīng)板（也稱神經(jīng)外胚層）、位于兩側(cè)的表皮外胚層和位于兩者之間的神經(jīng)板邊緣。神經(jīng)板彎曲、折疊、增厚并進(jìn)一步閉合，形成神經(jīng)管。閉合的神經(jīng)管沿胚胎背腹軸分化出不同的神經(jīng)祖細(xì)胞。神經(jīng)管形成的過程稱為神經(jīng)胚形成。中、內(nèi)胚層進(jìn)一步發(fā)育出體節(jié)、心臟、腸管等早期器官的原基，胚胎自此進(jìn)入更加復(fù)雜的器官發(fā)育階段。由于人早期胚胎樣品極難獲取，以上事件在人類胚胎中無法被直接探究和揭示。

　　胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)為探索人類胚胎早期發(fā)育提供了有力武器。借此，人d.p.f. 14之前的發(fā)育事件已被初步揭示。而人類胚胎體外研究存在必須在d.p.f. 14終止的倫理限制。因此，體外培養(yǎng)的人類胚胎不能被用于研究d.p.f. 14之后的原腸運(yùn)動和早期神經(jīng)胚發(fā)育等事件。非人靈長類與人類在進(jìn)化上和發(fā)育生物學(xué)特征上高度相似，是研究人早期胚胎發(fā)育的理想模型。因此，搭建非人靈長類胚胎體外培養(yǎng)體系，揭示非人靈長類胚胎發(fā)育特征，將提升科學(xué)家對包括人類在內(nèi)的靈長類早期胚胎發(fā)育及相關(guān)疾病的認(rèn)知。1995年，澳大利亞科學(xué)家將絨猴的囊胚體外培養(yǎng)至d.p.f. 11，用于研究靈長類動物胚胎植入后發(fā)育。2019年，中國科學(xué)院動物研究所王紅梅團(tuán)隊(duì)及國內(nèi)外同行將食蟹猴胚胎體外培養(yǎng)至d.p.f. 20，探討了靈長類早期原腸運(yùn)動特征。那么，靈長類胚胎中晚期原腸運(yùn)動和早期神經(jīng)胚發(fā)育有哪些特征？是否可以延長食蟹猴胚胎體外發(fā)育歷程，以進(jìn)一步剖析靈長類胚胎發(fā)育特征？這些問題是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域前沿?zé)狳c(diǎn)問題。

　　為了回答上述科學(xué)問題，研究建立了一個(gè)可支持食蟹猴胚胎體外發(fā)育至受精后25天的3D長時(shí)程培養(yǎng)體系，并基于該體系探析了靈長類胚胎中晚期原腸運(yùn)動和早期神經(jīng)發(fā)育過程中的核心事件和譜系特征。研究比較了人類和非人靈長類胚胎2D（2D Ibidi μ-plates和2D coated with Matrigel，Ibidi-2D和M-2D）和3D（3D low-adhesion 96-well with Matrigel，M-3D）體外培養(yǎng)體系，對不同體系中胚胎的大小和存活率進(jìn)行評估。研究顯示，2D和3D體系都能支持胚胎發(fā)育到d.p.f. 20。在2D體系下，胚胎由于胚外組織發(fā)育旺盛而迅速增大，但內(nèi)部的胚體發(fā)育并不好。而在3D體系下，胚胎的胚外組織生長受限，但胚體結(jié)構(gòu)顯著發(fā)育。這些特征提示2D體系優(yōu)先支持胚外組織生長，而胚外組織的過度生長可能限制了胚體本身的發(fā)育。為了保證胚體的發(fā)育，研究繼續(xù)優(yōu)化3D體系。已報(bào)道的人類胚胎M-3D體系需要在d.p.f. 9-14的培養(yǎng)基中連續(xù)添加Matrigel，以模擬人類胚胎植入后環(huán)境。鑒于食蟹猴胚胎植入子宮比人類胚胎淺表，因此研究僅在d.p.f. 10-12的培養(yǎng)基中加入Matrigel。優(yōu)化后的體系能支持33.7%（n = 91）的食蟹猴胚胎發(fā)育到d.p.f. 25。該體系被命名為3D長時(shí)程培養(yǎng)體系（prolonged in vitro culture，pIVC；圖1）。

　　為了探索靈長類早期神經(jīng)胚發(fā)育過程，研究對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控因子進(jìn)行鑒定。d.p.f. 20-22胚胎的胚體背側(cè)中部可檢測到OTX2⁺/OCT4⁺或OTX2⁺/SOX2⁺的細(xì)胞，提示OTX2的表達(dá)與外胚層細(xì)胞分化密切相關(guān)。PAX3和PAX6表達(dá)于d.p.f. 22-25的外胚層細(xì)胞，表明此時(shí)神經(jīng)外胚層的特化。在d.p.f. 24-25的胚胎中可檢測到神經(jīng)外胚層閉合的區(qū)域，提示神經(jīng)管形成。此外，OTX2、PAX8和NKX2.2陽性細(xì)胞分布于神經(jīng)管的前部、中部和后部，提示此時(shí)的胚胎已有前腦、中腦和后腦/脊髓的區(qū)域化。結(jié)合神經(jīng)管的形態(tài)特征，研究發(fā)現(xiàn)胚胎前部神經(jīng)管未閉合，后部神經(jīng)管已閉合。未閉合和已閉合的神經(jīng)管均表達(dá)N-CAD，而不表達(dá)E-CAD，表明胚胎在神經(jīng)管閉合之前已完成E-CAD向N-CAD的轉(zhuǎn)變。這些pIVC胚胎的神經(jīng)管形態(tài)和分子表達(dá)特征與體內(nèi)相同發(fā)育階段的胚胎相似（圖2）。伴隨神經(jīng)外胚層的發(fā)育，表皮和神經(jīng)板邊緣的發(fā)育同步進(jìn)行。熒光染色結(jié)果顯示，d.p.f. 22-25的胚胎已分化出TFAP2A⁺/E-CAD⁺的表皮細(xì)胞。在未閉合的神經(jīng)板兩側(cè)和閉合的神經(jīng)管兩側(cè)存在PAX3⁺/SOX9⁺/SLUG⁺細(xì)胞，標(biāo)志著神經(jīng)板邊緣和其分化的神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育。

　　為了剖析閉合的神經(jīng)管細(xì)胞是否具有沿背腹軸不對稱分化的模式，研究對d.p.f. 25胚胎的神經(jīng)管進(jìn)行鑒定。研究發(fā)現(xiàn)在閉合的神經(jīng)管背側(cè)存在PAX3陽性細(xì)胞、腹側(cè)存在FOXA2和NKX6.1陽性細(xì)胞，表明神經(jīng)管頂板（roof plate）和底板（floor plate）的特化。此外，β-tubulin Ⅲ⁺/OLIG2⁺細(xì)胞標(biāo)志著運(yùn)動神經(jīng)元祖細(xì)胞（progenitors of motor neurons）的特化；NKX2.2⁺/FOXA2⁺細(xì)胞標(biāo)志著腹側(cè)中間神經(jīng)元祖細(xì)胞（progenitors of ventral interneuron 3）的特化。與閉合的神經(jīng)管相比，OLIG2和NKX2.2未能在未閉合的神經(jīng)管中檢測到。這些分子表達(dá)特征與體內(nèi)對應(yīng)階段胚胎的特征一致，表明pIVC胚胎可重現(xiàn)神經(jīng)管沿背腹軸區(qū)域化發(fā)育的模式（圖3）。

　　除外胚層和神經(jīng)管發(fā)育外，研究還檢測了pIVC胚胎中原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells）以及中、內(nèi)胚層的發(fā)育特征。熒光染色結(jié)果顯示，SOX17⁺/TFAP2C⁺/BLIMP1⁺細(xì)胞可在d.p.f. 22-24的胚胎后部腹側(cè)被檢測到，提示pIVC胚胎可發(fā)育出原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞。在胚胎腹側(cè)的位置還可檢測到T⁺/CDX2⁺/OCT4^+/Low或T⁺/TBX6⁺/SOX2^-細(xì)胞，表明pIVC胚胎可發(fā)育出原條及其分化產(chǎn)物。此外，T⁺/TBX6⁺/SOX2⁺細(xì)胞的出現(xiàn)提示胚體存在類神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞（neuromesodermal progenitor）或前體節(jié)中胚層細(xì)胞（presomitic mesoderm）的特化。此外，研究可在pIVC胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢測到MYL7、NKX2-5、HAND1和GATA4共表達(dá)的細(xì)胞，提示pIVC胚胎或存在心臟中胚層樣細(xì)胞。單細(xì)胞多組學(xué)和熒光染色結(jié)果提示pIVC胚胎中可檢測到OTX2⁺/FOXA2⁺/SOX17⁺細(xì)胞，表明胚胎已分化出定型內(nèi)胚層（definitive endoderm）和卵黃囊（yolk sac）。與相同發(fā)育階段的體內(nèi)正常胚胎相比，pIVC胚胎的這些分子表達(dá)特征與正常胚胎相似，表明pIVC胚胎可重現(xiàn)原腸運(yùn)動中晚期階段中胚層和內(nèi)胚層的發(fā)育。

　　研究進(jìn)一步利用單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化和染色質(zhì)可及性測序，scChaRM-seq），對9個(gè)pIVC胚胎的3,850個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和1,862個(gè)單細(xì)胞的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性進(jìn)行測序和分析。結(jié)果提示，與本團(tuán)隊(duì)2022年在《自然》（Nature）報(bào)道的相同發(fā)育階段的食蟹猴胚胎單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫相比，pIVC胚胎可重現(xiàn)體內(nèi)正常胚胎的轉(zhuǎn)錄組特征。DNA甲基化分析提示，pIVC胚胎各種細(xì)胞類型的基因均發(fā)生了甲基化，且胚胎組織的DNA甲基化水平（~75%）高于胚外組織（~50%），這與已報(bào)道的小鼠和人類胚胎特征相似。

　　綜上所述，本研究建立了可支持食蟹猴胚胎體外發(fā)育至d.p.f. 25的3D pIVC體系，并基于該體系揭示了靈長類胚胎中晚期原腸運(yùn)動至早期神經(jīng)胚發(fā)育階段胚胎的形態(tài)、細(xì)胞組分、轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化和染色質(zhì)可及性等特征。該成果為闡釋人類早期胚胎發(fā)育機(jī)制、為早期胚胎發(fā)育異常相關(guān)疾病的病理研究提供了技術(shù)平臺。

　　5月11日，相關(guān)研究成果作為封面文章，以Neurulation of the cynomolgus monkey embryo achieved from 3D blastocyst culture為題，發(fā)表在《細(xì)胞》（Cell）上。該研究由動物所和美國賓夕法尼亞大學(xué)合作完成。

　　論文鏈接 

圖1.能夠支持食蟹猴胚胎體外發(fā)育至d.p.f. 25的3D長時(shí)程培養(yǎng)體系

圖2.pIVC胚胎神經(jīng)外胚層和神經(jīng)嵴的特化

圖3.pIVC胚胎神經(jīng)管細(xì)胞的特化