基因組DNA是生命的藍圖，對基因組DNA實現任意尺度的精準操作代表對生命藍圖進行修改繪制的底層能力，是基因工程技術發(fā)展的核心。以CRISPR基因編輯技術為代表的技術進步實現了基因組單堿基和短序列尺度的精準編輯，基本解決了基因組精準編輯的挑戰(zhàn)。然而，如何針對應用場景的需求，實現大片段DNA在基因組的高效精準整合，仍然是整個基因工程領域亟需突破的難題。該技術的突破意味著可以通過外源功能基因的精準寫入來干預多種不同位點基因突變導致的單基因遺傳缺陷等疾病，從而開發(fā)更為通用的基因與細胞療法，具有廣泛的應用前景。

針對這一重大技術挑戰(zhàn)，多種基因寫入技術已被開發(fā)，如CRISPR核酸酶介導的同源重組或非同源末端連接技術等，但是這些技術都依賴于DNA模板作為基因寫入的供體（donor）。在實際醫(yī)學應用中，DNA供體面臨免疫原性高、在體（in vivo）遞送困難、在基因組中具有隨機整合風險等諸多挑戰(zhàn)。相比之下，RNA供體具有免疫原性低、可被非病毒載體（如LNP）有效遞送、在細胞內迅速降解，無隨機整合風險等特點，能夠有效應對DNA供體所面臨的挑戰(zhàn)。因此，以RNA為供體的大片段精準寫入技術，在安全性、可遞送性方面都具有顯著的優(yōu)勢。然而，現有以RNA為供體的技術，要么無法實現>200 bp的DNA片段高效整合（如引導編輯等），要么依靠基因組隨機整合從而帶來基因組隨機突變風險（如逆轉錄病毒等）。是否能夠以RNA作為供體，實現功能基因尺度的大片段DNA基因組精準定點整合？仍然是基因工程領域面臨的挑戰(zhàn)。

7月8日，《細胞》（Cell）以長文形式在線發(fā)表了中國科學院動物研究所/北京干細胞與再生醫(yī)學研究院研究員李偉與周琪團隊合作完成的題為All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons的研究論文。該研究結合基因組數據挖掘和大分子工程改造等手段，開發(fā)了使用RNA供體進行大片段基因精準寫入的R2逆轉座子工具，能夠在多種哺乳動物細胞系、原代細胞中實現大片段基因（>1.5 kb）高效精準的整合，最高效率超過60%，成功實現了全RNA介導的功能基因（DNA）在多種哺乳動物基因組的精準寫入，為新一代創(chuàng)新基因療法的發(fā)展奠定了基礎。

作為基因組進化的源動力之一，轉座子可以通過在不同基因組間的“跳躍”，實現自我的復制與擴增。其中，以RNA作為媒介的R2逆轉座子的“跳躍”機制與以RNA作為供體的基因寫入工具的開發(fā)思路不謀而合。同時，該類逆轉座子天然傾向于整合在真核生物固定的28S rDNA基因組位點，這一位點在人基因組中拷貝數目多（約219個），且遠離蛋白編碼基因，是適合于外源基因整合的安全港位點（“safe harbor”loci）。因此，R2逆轉座子是以RNA為供體的大片段基因寫入工具開發(fā)的有力的候選者。然而，盡管R2逆轉座子早在上世紀80年代就被發(fā)現，其在哺乳動物細胞中的功能性質尚未被系統(tǒng)性地探索，迄今為止，未能被利用來在哺乳動物細胞中實現大片段功能基因的有效整合。

在本研究中，研究團隊首先通過數據挖掘，全面系統(tǒng)地分析了自然界中R2逆轉座子元件的生物多樣性；通過構建基于RNA供體的基因寫入的報告體系，成功篩選出在哺乳動物細胞中具有完整GFP功能基因整合活性的R2Tg系統(tǒng)（來源于一種鳥Taeniopygia guttata的基因組）。隨后，研究團隊針對R2Tg系統(tǒng)發(fā)揮功能所必需的兩個關鍵組分：R2蛋白質以及供體RNA，進行了系統(tǒng)性的功能探索與工程化改造，最終獲得了在人細胞系中基因整合效率超過20%的en-R2Tg工具（圖1）。

由于R2蛋白質可以通過mRNA表達，且供體RNA本身也是RNA，那么，en-R2Tg工具能否以全RNA形式介導的基因的高效精準寫入？為了探究這一點，研究人員通過體外合成獲得了編碼R2蛋白質mRNA以及供體RNA，并使用脂質體遞送的方式將兩條mRNA導入人的細胞中。結果顯示，en-R2Tg工具能夠高效整合多個與疾病治療相關基因，且這些基因能夠有效表達功能蛋白。能夠以全RNA的形式發(fā)揮功能，意味著en-R2Tg工具可以使用安全性已經在臨床上得到證明的LNP納米材料來進行遞送，這將有可能解決長久以來基因寫入工具依賴病毒載體進行高效遞送的難題。研究發(fā)現，使用LNP遞送en-R2Tg工具在人的肝臟細胞系中能夠實現25%的基因整合效率。此外，研究還證明了R2工具在人類原代細胞中同樣具有活性；同時，通過顯微注射將en-R2Tg工具導入小鼠胚胎，成功實現了超過60%的GFP基因定點整合效率。

本研究的另一關鍵點在于，工程化改造的en-R2Tg工具是否還保留有天然R2逆轉座子的28S rDNA位點特異性整合這一性質？為了回答這一問題，研究人員結合無偏好的基因整合富集高通量測序以及全基因組三代測序方法，發(fā)現en-R2Tg工具在全基因組范圍內展現了極高的基因整合特異性，大于99%的外源基因都精準整合到28S rDNA安全港位點。同時，結合qRT-PCR以及RNA-Seq實驗，研究發(fā)現en-R2Tg工具對細胞的轉錄組狀態(tài)幾乎沒有影響。這說明en-R2Tg介導的基因寫入是位點精準特異的，可以有效避免逆轉錄病毒等技術所產生的基因隨機整合導致的基因突變風險。

綜上，該研究基于自然界存在的R2逆轉座系統(tǒng)，結合數據分析和工程化改造方法，成功開發(fā)了全RNA介導的、高效精準的基因寫入技術，首次在多種人和小鼠細胞系及原代細胞中實現了功能基因的定點整合（圖2）。R2基因精準寫入工具在遞送和安全性方面具有顯著優(yōu)勢，未來有望基于此工具開發(fā)在體功能基因回補寫入以及在體生成CAR-T細胞等全新的疾病治療方法。值得注意的是，R2基因寫入技術目前無法實現在不同基因組位點的可編程寫入，且在人原代細胞中的基因寫入效率較低，因此未來需要進一步發(fā)展和優(yōu)化。

該研究由中國科學院動物研究所與北京干細胞與再生醫(yī)學研究院合作完成，李偉與周琪為共同通訊作者。研究工作得到科學技術部、國家自然科學基金委員會、中國科學院以及北京市自然科學基金等的支持。

論文鏈接

圖1.?系統(tǒng)的工程化改造獲得en-R2Tg工具

圖2.?開發(fā)全RNA介導的、高效精準的哺乳動物細胞大片段功能基因寫入工具